使用方法

1) 取出印記膜，加入合適的封閉液在溫室下孵育20-60分鐘，同時(shí)振蕩，以封閉膜上非特異性蛋白結(jié)合位點(diǎn)。

2) 將膜從封閉液中取出，與一抗工作液在溫室孵育1小時(shí)，同時(shí)振蕩；或在28℃孵育過夜，不振蕩。

3) 將足量的洗滌緩沖液加至膜上，保證緩沖液將膜*覆蓋。振蕩孵育≥5分鐘，更換洗滌緩沖液并重復(fù)該步驟4-6次。增加洗滌緩沖液體積，洗滌次數(shù)和洗滌時(shí)間有助于降低背景信號(hào)。

注：1）孵育前，膜在洗滌緩沖液中的短暫淋洗會(huì)提高洗滌效率；2）按前文建議的HRP標(biāo)記二抗稀釋度非常重要的。

4) 將HRP標(biāo)記的二抗工作液與膜在溫室孵育1小時(shí)，同時(shí)振蕩。

5) 重復(fù)步驟3，以除去未結(jié)合的HRP標(biāo)記二抗。注：膜與HRP標(biāo)記二抗孵育后必須進(jìn)行*洗滌。

6) 將A溶液與B液等比例混合，制備成工作液。每cm2膜使用0.01～0.1ml工作液，工作液可以在溫室下穩(wěn)定8小時(shí)。

7) 將印記膜在工作液中孵育5分鐘。從工作液中取出印記膜，并置于一個(gè)塑料片或清潔的塑料紙（膜）中，用一張吸水紙吸除多余的液體，并從印記和塑料紙之間小心地壓出氣泡。

8) 將包在塑料紙（膜）中的印記膜置于膠片暗盒中，蛋白質(zhì)面朝上，除適用于膠片曝光的燈（如紅色安全燈）之外，關(guān)閉所有的燈。

注;1）膠片必須在曝光期間保持干燥；2）確保將多余的底物從膜和塑料紙上*去除；3）在整個(gè)膠片處理期間，使用手套。

9) 將X光膠片置于膜的上面。建議次曝光60秒。之后可調(diào)整曝光時(shí)間以達(dá)到結(jié)果?；瘜W(xué)發(fā)光反應(yīng)在底物孵育后的前5-30分鐘期間是強(qiáng)烈的。這一反應(yīng)可以持續(xù)幾個(gè)小時(shí)，但強(qiáng)度會(huì)隨時(shí)間下降，如有底物孵育后較長(zhǎng)時(shí)間后曝光，曝光時(shí)間可能需要延長(zhǎng)以獲得較強(qiáng)信號(hào)。如果使用磷光存儲(chǔ)成像設(shè)備（如Bio-Rad的分子成像儀系統(tǒng)）或CCD照相機(jī)可能需要較長(zhǎng)的曝光時(shí)間。

    注：膠片與膜之間的任何移動(dòng)可能在膠片上造成人為的非特異信號(hào)。

10）使用合適的顯影劑和定影劑對(duì)膠片進(jìn)行顯影。如果信號(hào)強(qiáng)，則縮短曝光時(shí)間或?qū)⒂∮浤みM(jìn)行剝離并降低抗體濃度重新檢測(cè)。